肺动脉高压与DNA甲基化

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表观遗传学(Epigenetics)是基因和环境之间的相互作用的中间环节,在不改变基因序列的情况下,调控基因表达与细胞表型发生变化,表观调控是可以遗传的[1]。表观调控的可遗传性是通过非序列依赖性DNA变异实现的,表观遗传信息可以被传送到细胞、组织和生物体。因此,表观遗传学不仅在基因调控和遗传方面提供了新视点,而且在生物进化与发展方面也提出了挑战。另外,通过对环境因素的测试发现:无论是应激还是感染因素都能影响基因的表达,而且这些潜在的表观修饰贯穿了有机生物体的整个生命周期中,比如生命早期在子宫内的环境所引起的表观改变可以在组织和细胞内累积,出生后仍可调控基因的表达模式和细胞表型,并且参与调控出生后的疾病发生[2-5]。表观遗传学包括三个主要机制:DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白乙酰化及microRNAs修饰,并且表观调控是可以通过治疗逆转[6]。

目前越来越多的研究表明表观遗传机制参与了肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH) 显示名称 的病因与表型的调控,microRNAs修饰在肺动脉高压领域研究较多[7-11],而DNA甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化等表观修饰在PH中研究较少,本文着重综述DNA甲基化在PH发生发展中可能的作用。

1.DNA甲基化

DNA甲基化是最早发现的表观遗传学修饰途径之一,不改变DNA的序列,其通过引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,进而引起DNA表达及细胞表型的改变,不同的甲基化程度影响基因表达的活性。DNA甲基化是在甲基转移酶(DNA methytransferases,DNMTs)的催化下,CG二核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象,通常发生在5′胞嘧啶位置上,生成m5CpG[12]。哺乳动物中DNA甲基转移酶有两种:①DNMT1——持续性DNA甲基转移酶,作用于仅有一条链甲基化的DNA双链,使其完全甲基化,也可参与DNA复制双链中的新合成链的甲基化,DNMT1可能直接与组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase,HDAC)联合作用阻断转录;②DNMT3a、DNMT3b——从头甲基转移酶,它们可甲基化CpG,使其半甲基化,继而全甲基化。从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控,其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用[13]。甲基化位点可随DNA的复制而遗传,因为DNA复制后,甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。在生物体内DNA甲基化主要形成有:5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)[14]。

基因组中60%~90%的CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛(CpG islands),该区域至少含有200 bp,有大量相联的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G),以及使两者相连的磷酸酯键(p),GC所占比例超过50%,CpG岛位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点[15],与基因相连,可用来作为限制酶的辨识位置,人类基因中的启动子含有约70%的CpG岛。未甲基化CpG岛可能说明基因具有潜在活性,DNA甲基化状态是调控基因转录的“开关”,DNA高甲基化时,遏制转录,而DNA低甲基化或未甲基化时,转录增强。DNA甲基化在人类健康与疾病中起重要作用,尤其在癌症方面,主要表现为癌基因启动子区域的低甲基化,抑癌基因启动子区域的高甲基化,从而促进肿瘤形成[16]。可变的DNA甲基化位点在整个基因组分布是不均一的,但甲基化在基因中的调控作用主要集中在以下几点:调节转录、细胞生长、代谢、分化和肿瘤形成。

DNA甲基化调控基因表达主要有两方面的机制,其一:DNA甲基化本身可以阻碍CpG二核苷酸,包括cis-DNA在内的绑定元件,与转录因子的结合。这个机制阐明了一些转录调节器与靶基因的转录因子无关,而是受DNA甲基化调控[15]。其二:甲基化CpG结合域粘附蛋白家族可以特异性识别哺乳动物的甲基化标记,包括4种同源性甲基化DNA结合域(MBD)粘附蛋白:MBD1,MBD2,MBD4和MeCP2,及最近发现的非同源性的Kaiso蛋白,其也有紧密粘附甲基-CpG二核苷酸的特点[15]。这些甲基化CpG粘附蛋白可以直接抑制转录,阻止与激活的转录因子结合,或募集催化组蛋白翻译后修饰和染色质重塑复合体的酶,改变核染色质的结构,积极促进转录抑制[17]。这表明甲基化CpG粘附蛋白在DNA甲基化方式的选择,以及DNA甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用。

DNA甲基化的研究多集中在癌症、干细胞和神经系统疾病相关领域,以前针对疾病相关特异性基因甲基化位点的研究较多。而近年来,随着芯片技术及高通量测序技术的发展,对全基因组甲基化谱的研究逐年增多,涉及多个领域,如癌症[18,19]、原发性高血压[20]、炎症性肠病[21]和慢性肾功能不全[22]等,这些研究大大提高了人类对DNA甲基化在疾病中整体影响的认识。当机体遇到环境应激原刺激时,如:毒物、微生物和病毒的暴露等,特定组织内DNA甲基化可变位点将会发生改变,进而影响了基因的活性和细胞表型。这种改变积累到一定程度时能引起持续的细胞代谢稳态的改变,并且机体对这种刺激的反应能力一直维持着,进而导致疾病的发生。这些变化反映了基因与环境相互作用的分子结果。

2.PH的肺血管重塑

PH是由多种原因引起的肺灌注和通气异常,引起肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)增加,最终引起肺动脉压(pulmonary artery pressure,PAP)增高、右心功能不全,而右心衰竭 显示名称 是患者死亡的主要原因。PH临床表现无特异性,常表现为劳累性呼吸困难、胸痛、易于疲劳,有时出现晕厥,继而出现腿部和踝部水肿。右心漂浮导管测压是目前临床测定肺动脉压力最为准确的方法,也是评价各种无创性测压方法准确性的“金标准”。PH的判定标准:静息时右心导管测量肺动脉平均压(mPAP)>25mmHg。PH是环境与基因相互作用的一类复杂的疾病,其临床表现各异,但组织学表现相似。组织学主要表现为三个共同特征:肺血管重塑、丛样病变和原位血栓形成。

从严格意义来说,PH不是肺部疾病,而是发生在肺部、影响到心脏的微血管病。在细胞水平,PH是以炎症、肺血管张力失衡、肺动脉内皮细胞(Pulmonary Artery Endothelial Cell,PAEC)功能紊乱、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)过度增殖、凋亡抵抗和原位血栓形成为特征[23]。肺微血管重塑是PH产生的病理生理基础。慢性缺氧为肺血管细胞营造了炎症的环境,同时引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放增多。在炎症和ROS双重作用下造成肺血管重塑。炎症引起生长因子、细胞因子和化学因子刺激细胞增殖,延长细胞存活期[23, 24]。持续的炎症既可引起DNA损伤,也能引起凋亡抵抗。ROS可以激活TGF-β等生长因子,使得外膜纤维母细胞激活,向肌成纤维细胞分化,并向肺血管中膜层移行,造成中膜肥厚。同时在细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)产生纤粘蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白。这些ECM蛋白进一步刺激PASMC增殖,形成PH的恶性循环[25]。

内皮细胞功能主要表现为调节血管张力,血管生成,免疫细胞粘附、迁移、和止血功能。内皮细胞功能紊乱,包括凋亡、增殖、与平滑肌细胞相互作用、细胞表型转化等,可见于多种病理过程,如:动脉粥样硬化、同种异体血管病、高血压、充血性心脏病、败血症、各种炎症综合征和PH[26]。环境中的毒物、ROS、自身免疫抗体、流体剪切力等均可引起内皮细胞损伤。有研究将人肺微血管内皮细胞加到体外人工毛细管中,注入VEGF受体拮抗剂,在慢性缺氧的环境中培养,24h后发现35.8%的内皮细胞凋亡,随即发现存活的细胞呈现过度增殖,凋亡抵抗,并且这种细胞表型表达肿瘤标记物survivin[27],内皮细胞表型的改变是基因与环境相互作用的结果。一些危险因素使内皮细胞损伤后立即发生凋亡,随后存活的内皮细胞转化为抗凋亡表型,表现为过度增殖,并且微血管内皮细胞的凋亡可刺激血管平滑肌细胞过度增殖[28]。内皮细胞功能紊乱在严重PH的微血管重塑中起非常重要的作用。PH患者的微小肺动脉内丛样病变被证明由内皮细胞功能失调所致[29]。

3.DNA甲基化参与调控PH的肺血管重塑

DNA甲基化对心血管疾病领域的研究近来逐渐增多[30, 31],在PH发病中的作用也开始被认识[32, 33]。DNA甲基化调控失调与PH的产生密切相关。针对PH先天模型FHR大鼠的研究发现:FHR大鼠PASMC表达超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase,SOD2)降低,导致线粒体低极化,H2O2产生减少,损害了机体氧化应激信号通路,激活缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α),使得PASMC过度增生,凋亡抵抗,从而诱发PH。进一步研究发现SOD2基因本身没有突变,而是该基因内含子2区域存在DNA高甲基化,从而抑制了SOD2的表达,向FHR大鼠腹腔内注入SOD类似物或甲基化转移酶抑制剂时,该模型的PAP和PVR可以逆转,FHR大鼠模型PASMC存在的这种特异性表观修饰机制,为PH的治疗提供了新的靶点[34, 35]。

一项研究发现无论人还是鼠的血管内皮细胞之所以能特异性并持续性表达内皮源性一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),是因为血管内皮细胞eNOS基因启动子区域存在显著的低甲基化,而其他类型细胞,如人血管PAMSC、各种肿瘤细胞系的eNOS基因启动子区域存在DNA高甲基化,均不表达eNOS,但如果使用甲基化转移酶抑制剂治疗可以使鼠的PAMSC表达eNOS增多,说明这种调控是可以逆转的[36]。关键基因启动子区域可变的甲基化状态参与调控了人类胎盘来源的静脉和动脉内皮细胞的分化[37]。DNA甲基转移酶抑制诱导小鼠胚胎干细胞向血管内皮细胞分化[38]。内皮细胞合成的血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、NOTCH4、内皮生长因子-1受体(endothelial growth factor receptor-1,VEGF-1)、内皮素和eNOS的基础表达时受表观调控,例如组蛋白H3/H4去乙酰化、H3K4甲基化等,激活组蛋白翻译后修饰[39]。在新生儿持续的肺动脉高压(Persistent pulmonary hypertension of the newborn,PPHN)模型研究中发现:胎鼠肺动脉eNOS基因的启动子区域的组蛋白H3/H4去乙酰化水平高于对照组,且该区域总甲基化水平低于对照组,说明中PPHN模型肺动脉内皮eNOS表达水平的升高受到DNA甲基化调控[40]。以上研究表明在PH患者或动物模型中的肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞都参与了PH的微血管重塑,而且血管重塑与DNA甲基化调控密切相关。

4.小结

血管内皮细胞、中层平滑肌细胞功能紊乱及其向抗凋亡表型转变是PH患者远端肺微血管重塑的主要原因。目前研究结果中诸多证据显示表观遗传机制参与调控了PH的肺血管重塑,microRNA参与调控PH的发病机制研究成果较多,而DNA甲基化作为主要的表观遗传调控机制之一,近年来也有越来越多的证据呈现出参与了PH的微血管重塑,对PH患者或模型动物肺动脉平滑肌细胞或内皮细胞的相关基因的差异甲基化位点或外周血全基因组的甲基化谱的进一步研究,将有助于我们对PH发生发展的理解,为PH的治疗探索新的靶标。

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作者

王辰 许启霞

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